項(xiàng)目名稱(chēng)：    乙肝表面抗原-抗體復(fù)合物消除免疫耐受的應(yīng)用基礎(chǔ)研究

推薦單位：    教育部

項(xiàng)目簡(jiǎn)介：    本項(xiàng)目屬基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

幼齡感染乙肝病毒所致的免疫耐受是學(xué)者面臨的重要難題，誘生有效針對(duì)乙肝病毒的機(jī)體免疫應(yīng)答是消除耐受的關(guān)鍵，但因缺乏系統(tǒng)的應(yīng)用基礎(chǔ)性研究，尚未取得突破性進(jìn)展。在鴨乙肝動(dòng)物模型中首次發(fā)現(xiàn)病毒抗原-抗體復(fù)合物可消除免疫耐受的基礎(chǔ)上，本項(xiàng)目對(duì)乙肝病毒表面抗原（HBsAg）-抗體 (anti-HBs)復(fù)合物（IC）經(jīng)抗原呈遞細(xì)胞（APC）作用后的機(jī)制與效應(yīng)提出設(shè)想，系統(tǒng)研究消除免疫耐受的機(jī)理，并在臨床研究中予以驗(yàn)證。

（1）用體外共孵育方法，發(fā)現(xiàn)IC提高了APC攝取及呈遞HBsAg的功能，特異地激活T細(xì)胞，促進(jìn)產(chǎn)生Th1類(lèi)細(xì)胞因子。在HBsAg陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因鼠中用復(fù)合物免疫，可增強(qiáng)特異性殺傷性T細(xì)胞的作用，增加Th1類(lèi)細(xì)胞因子的分泌，誘生抗-HBs。發(fā)現(xiàn)復(fù)合物中抗HBs 的Fc段是介導(dǎo)上述作用的關(guān)鍵；用蛋白酶去除抗HBs Fc段，或換用異種動(dòng)物抗體，則作用顯著降低。

（2）鑒于IC是通過(guò)外源性抗原呈遞途徑誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答，在此基礎(chǔ)上，創(chuàng)新性地設(shè)計(jì)經(jīng)外源、內(nèi)源性?xún)煞N途徑呈遞HBsAg的方法，將帶有編碼乙肝表面抗原基因的質(zhì)粒DNA加入復(fù)合物組成IC-HBS質(zhì)粒DNA三重復(fù)合物，在HBsAg陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因鼠中可降低肝細(xì)胞內(nèi)HBsAg。獲我國(guó)、歐、美授權(quán)發(fā)明專(zhuān)利。發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA 中CpG有利于局部誘生Th1細(xì)胞因子；機(jī)械注射在小鼠皮膚內(nèi)可通過(guò)Toll-樣受體-9介導(dǎo)釋放細(xì)胞因子。

（3）借助APC表面標(biāo)記檢測(cè)及T細(xì)胞激活試驗(yàn)，在乙肝患者中證實(shí)APC與T細(xì)胞間相互作用低下。用復(fù)合物免疫正常人，可誘生高效價(jià)抗體及Th1細(xì)胞因子；用復(fù)合物免疫患者，患者的Th1類(lèi)細(xì)胞因子表達(dá)升高，且血清中出現(xiàn)HBeAg抗體及病毒滴度下降，驗(yàn)證了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所揭示的機(jī)制。本研究為有效治療乙肝患者奠定了理論基礎(chǔ)。

10篇主要論文被Lancet Infectious Diseases, Nature Review Microbiology，Nature Biotechnology , Hepatology 等引用101次。

主要發(fā)現(xiàn)點(diǎn)：  1．發(fā)現(xiàn)乙肝病毒表面抗原（HBsAg）與高親和力抗體（抗-HBs）組建的抗原-抗體免疫原性復(fù)合物 （Immuogenic complex,IC）與傳統(tǒng)認(rèn)為引起III型變態(tài)反應(yīng)的抗原-抗體免疫復(fù)合物有本質(zhì)不同的作用。IC通過(guò)其中抗體Fc段的介導(dǎo)，經(jīng)抗原呈遞細(xì)胞表面的Fc受體，將IC中的HBsAg被動(dòng)地帶入抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)，使原來(lái)因免疫耐受而不能識(shí)別HBsAg的抗原呈遞細(xì)胞增強(qiáng)攝取HBsAg。經(jīng)過(guò)加工的HBsAg呈遞給T細(xì)胞，激活的T細(xì)胞可誘生T殺傷性細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞因子及體液免疫應(yīng)答。而引起III型變態(tài)反應(yīng)的抗原-抗體復(fù)合物或因抗原-抗體比例不當(dāng)，或因抗體親和力低下，在血循環(huán)中長(zhǎng)期、大量存在,沉積在小血管內(nèi)壁，引起疾病。（屬醫(yī)學(xué)微生物學(xué)科及免疫學(xué)科。代表性論文 1，2，4及中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利 ZL93112409）.

2．發(fā)現(xiàn)在HBsAg-抗-HBs復(fù)合物中加入重組編碼S基因質(zhì)粒DNA 組建-三重復(fù)合物，可更有效地消除對(duì)乙肝病毒抗原的免疫耐受。HBsAg-抗-HBs復(fù)合物是通過(guò)細(xì)胞攝入而加工、呈遞，屬外源性抗原呈遞過(guò)程；質(zhì)粒S-DNA則通過(guò)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)HBsAg抗原，經(jīng)內(nèi)源性抗原加工呈遞過(guò)程。推測(cè)如HBsAg經(jīng)外源性及內(nèi)源性?xún)煞N不同途徑進(jìn)行抗原呈遞，可更有效地誘生特異性免疫應(yīng)答。在HBsAg陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因鼠中，用三重復(fù)合物免疫，更有效地激活T殺傷細(xì)胞，激發(fā)Th1類(lèi)細(xì)胞因子，顯著降低肝內(nèi)HBsAg。此外，還發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA中的CpG核苷酸序列可在局部形成有利于TLR9陽(yáng)性細(xì)胞歸巢，促進(jìn)淋巴結(jié)細(xì)胞表達(dá)IL-12 mRNA，提供Th1型免疫反應(yīng)的微環(huán)境。（屬醫(yī)學(xué)微生物學(xué)科，及免疫學(xué)科。代表性論文 4，7，8，9，10。獲中、美、歐洲發(fā)明專(zhuān)利授權(quán)，專(zhuān)利號(hào)分別為ZL971062919,6221664B1, 0913157）

3．發(fā)現(xiàn)在慢性乙肝患者中HBsAg-抗-HBs復(fù)合物有消除免疫耐受的作用。慢性乙肝患者中，抗原呈遞細(xì)胞-T細(xì)胞間相互作用功能低下。慢性乙肝患者樹(shù)突狀細(xì)胞經(jīng)與復(fù)合物孵育后，CD80,CD86,CD40,HLA-II 標(biāo)記表達(dá)上調(diào)，IL-12分泌水平也提高。慢性乙肝患者注射HBsAg-抗-HBs復(fù)合物后，Th1 類(lèi)細(xì)胞因子升高，HBeAg轉(zhuǎn)陰，出現(xiàn)e抗體，血清病毒DNA降低。此外，正常人用復(fù)合物免疫后可產(chǎn)生高效價(jià)抗-HBs 及Th1類(lèi)細(xì)胞因子。（屬醫(yī)學(xué)微生物學(xué)科、及傳染病學(xué)科。代表性論文3，5，6）

主要完成人：  1.   聞?dòng)衩?/P>

提出免疫耐受及消除免疫耐受的設(shè)想。對(duì)本項(xiàng)目提出整體思路及設(shè)計(jì)，提出階段性研究課題。設(shè)計(jì)鴨乙肝，鼠、轉(zhuǎn)基因鼠以及乙肝患者的全部實(shí)驗(yàn)。參加鴨乙肝動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及部分小鼠實(shí)驗(yàn)。參加IC的具體配比及三重復(fù)合物的實(shí)驗(yàn)研究及部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，指導(dǎo)研究生及研究人員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與總結(jié)，撰寫(xiě)論文(論文1-5,論文9-10)，對(duì)第一、二及三點(diǎn)均有創(chuàng)造性貢獻(xiàn)，在該項(xiàng)研究中的工作量占本人工作量的60%。

2.   袁正宏

1．組建了擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的帶有編碼HBsAg的基因重組質(zhì)粒DNA（發(fā)明專(zhuān)利號(hào)：ZL01105250）；

2．發(fā)現(xiàn)了皮膚中TLR9的表達(dá)可受應(yīng)急和外傷等誘導(dǎo)，識(shí)別CpG后可快速產(chǎn)生細(xì)胞因子，部分揭示了皮膚先天免疫的機(jī)制，以此為基礎(chǔ)建立了物理?yè)p傷和CpG DNA作為佐劑的增強(qiáng)疫苗接種免疫效果的新策略。

3．參與實(shí)施了乙克治療性疫苗的部分臨床實(shí)驗(yàn)，為開(kāi)展臨床實(shí)驗(yàn)的研究打下了

良好基礎(chǔ)。

論文為6-10，對(duì)第二及三點(diǎn)有創(chuàng)造性貢獻(xiàn)，在該項(xiàng)研究中的工作量占本人工作量的60%。

3.   瞿滌

負(fù)責(zé)該項(xiàng)目鴨乙肝病毒分離及抗原抗體血清學(xué)研究方法的建立，參加小鼠抗原-抗體-DNA的實(shí)驗(yàn)及設(shè)計(jì)，乙肝患者DC細(xì)胞免疫功能的研究，論文為2,4,5,10，對(duì)第二及三點(diǎn)有創(chuàng)造性貢獻(xiàn)，在該項(xiàng)研究中的工作量占本人工作量的55%。

4.   姚忻

參加治療性乙肝疫苗抗原抗體配比實(shí)驗(yàn)，參加轉(zhuǎn)基因鼠的實(shí)驗(yàn)以及其他的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。乙克臨床研究病人血淋巴細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞的功能研究實(shí)驗(yàn)。具體進(jìn)行流式細(xì)胞CBA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病人各階段血清和外周血淋巴細(xì)胞特異性TH1/TH2細(xì)胞因子表達(dá)情況。論文為4，對(duì)第二及三點(diǎn)有創(chuàng)造性貢獻(xiàn)，在該項(xiàng)研究中的工作量占本人工作量的70%。

5.   何麗芳

參加該項(xiàng)目全過(guò)程。具體指導(dǎo)并參與有關(guān)組建抗原-抗體復(fù)合物的實(shí)驗(yàn)研究及部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

參加轉(zhuǎn)基因鼠的實(shí)驗(yàn)工作，參加整理與分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

論文為4與10，對(duì)第一及二點(diǎn)有創(chuàng)造性貢獻(xiàn)，在該項(xiàng)研究中的工作量占本人工作量的50%。

10篇代表性論文：  1.   Enhanced immunogenicity in mice with Hepatitis B vaccine complexed to human hepatitis B immunoglobulin. Chinese Medical Journal.1994:107 (10): 741-744

2.   Antigen-antibody complex as therapeutic vaccine for viral hepatitis B. Inter Rev Immunol 1999; 15:251-258.

3.   Hepatitis B vaccine and anti-HBs complex as approach for vaccine therapy. The Lancet 1995; 345: 1575-1576

4.   Therapeutic efficacy of hepatitis B surface antigen-antibodies-recombinant DNA composite HBsAg transgenic mice. Vaccine 2001: 19:4219-4225.

5.   Selective functional deficit in dendritic cell-T cell interaction is a crucial mechanism in chronic hepatitis B virus infection. J Viral Hepatitis 2004; 11:217-224.

6.   Toll-like receptor-9 induced by physical trauma mediates release of cytokines following exposure to CpG motif in mouse skin. Immunology. 2003:110:341-347

7.   Th2 immunity to HBsAg primed by gene gun DNA vaccination can be shifted towards Th1 immunity by co-delivery of CpG motifs-containing ODN. Scandinavian Journal of Immunology. 2003, 58:350-357.

8.   CpG motif acts as a danger signal and provides a T helper type 1-biased microenvironment for DNA vaccination. Immunology. 2005 Jun;115(2):223-30.

9.   Vaccination with recombinant HBsAg-HBIG complex in healthy adults. Vaccine 2005; 23:2658-2664

10.  Effect of Plasmid DNA on Immunogenicity of HBsAg-Anti-HBs Complex.. Viral Immunology 1998 ; 11；65-72