項目名稱：    醫(yī)學分子診斷新技術的研究

推薦單位：    寧波市

項目簡介：    1. 科學技術領域：本項目屬基礎醫(yī)學類醫(yī)學分子生物學領域。

2. 主要內(nèi)容：（1）在國際上首次聯(lián)用免疫磁珠陽性和陰性篩選及定量逆轉錄聚合酶鏈反應（PCR）技術，建立了外周血中微量消化系統(tǒng)惡性腫瘤細胞檢測及判斷其臨床意義的醫(yī)學分子診斷新技術。（2）以癌胚抗原（CEA）mRNA作為分子標志，采用免疫磁珠/RT-PCR技術檢測胃癌患者外周血中的癌細胞，分析了其陽性檢出率與病期的相關性，發(fā)現(xiàn)早期患者也有25%的陽性率；在結直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)CEA mRNA的檢出率與Dukes 分期呈正相關。（3）結腸癌患者外周血細胞角蛋白20（CK20） mRNA 的檢出率與腫瘤大小、淋巴結及肝轉移相關。（4）通過對肝癌、肝硬化和肝炎患者外周血中甲胎蛋白（AFP）mRNA的系統(tǒng)比較研究，發(fā)現(xiàn)這一分子標志在肝癌鑒別診斷和血道轉移監(jiān)測方面比AFP蛋白更有優(yōu)越性。（5）應用PCR、PCR-AFLP、PCR-RFLP、SSCP、DHPLC、DNA測序等研究技術，對男性不育、表皮松解性掌跖角化癥、注意缺陷多動障礙等常染色體顯性遺傳病和多基因疾病進行了疾病易感基因的尋找、基因突變譜的繪制、遺傳咨詢等研究工作；（6）新技術應用于腫瘤微轉移、遺傳病的診斷中，產(chǎn)生了較大的社會效益。

3. 科學價值：先用陰性免疫磁珠去除絕大部分的白細胞，然后用陽性免疫磁珠富集腫瘤細胞，最后用特異性高的定量RT-PCR分析腫瘤細胞特異的mRNA，建立了可靠而穩(wěn)定的分析外周血微量消化系統(tǒng)惡性腫瘤細胞的方法。結合了免疫磁珠與RT-PCR兩者的優(yōu)點，使檢測的特異度和靈敏度均大大提高。優(yōu)于文獻報道的方法；同時克服了單獨使用RT-PCR具有一定假陽性和假陰性的缺點。遺傳性疾病的研究中，不少方面的成果是國際首報，對探討幾種遺傳病的分子機制、分子診斷和產(chǎn)前診斷等，都具有一定的重要理論意義和應用價值。

4. 同行引用評價：被他人正面引用31次，其中SCI文章14篇。在4家醫(yī)療機制推廣應用。

主要發(fā)現(xiàn)點：  1.聯(lián)用陰性和陽性免疫磁珠及實時定量RT-PCR檢測外周血惡性腫瘤細胞方法的建立：先用CD45免疫磁珠去除絕大部分的白細胞，然后用上皮細胞特異的Ber-EP4免疫磁珠富集腫瘤細胞，最后用特異性高的實時定量RT-PCR檢測腫瘤細胞中的標志mRNA，以確定血道中癌細胞的組織來源。本方法的特異度和靈敏度均高于國內(nèi)外文獻報道的。（醫(yī)學分子生物學；論文[1]、[2]）

2.以癌胚抗原（CEA）mRNA作為分子標志，發(fā)現(xiàn)胃癌、結直腸癌血道轉移是一個較普遍的早期事件。以細胞角蛋白20（CK20）mRNA作為分子標志，發(fā)現(xiàn)結直腸癌外周血癌細胞檢出率與腫瘤原發(fā)灶大小、淋巴結及肝轉移相關。通過對肝癌、肝硬化和肝炎患者外周血中甲胎蛋白（AFP）mRNA的系統(tǒng)比較研究，發(fā)現(xiàn)AFP mRNA檢測在肝癌鑒別診斷和血道轉移監(jiān)測方面比AFP蛋白檢測更具有優(yōu)越性。（醫(yī)學分子生物學；論文[1]、[3]、[4]、[5]）

3.分析了我國表皮松解性掌跖角化癥家系的KRT 9基因突變，探討了基因突變與臨床表現(xiàn)的關系，在國際上首先發(fā)現(xiàn)1種新的突變，被國際中間纖維突變數(shù)據(jù)庫收錄。通過對注意缺陷多動障礙（ADHD）患者兒茶酚-O-甲基轉移酶(COMT)基因的分析，發(fā)現(xiàn)漢族兒童注意缺陷多動障礙患者的COMT基因 Val 158 Met多態(tài)性與ADHD無關聯(lián)，首次提出不能以COMT基因作為一個關聯(lián)因素應用于ADHD的臨床分子診斷。（分子遺傳學；論文[6]、[7]、[8]）

4.采用多重PCR的方法，對分布于AZF區(qū)與精子產(chǎn)生有關的3個區(qū)域內(nèi)的4個STS位點：sY86（位于AZFa亞區(qū)）、sY127（位于AZFb亞區(qū)）、sY254 和sY255（位于AZFc亞區(qū)）進行缺失檢測，同時用RT-PCR技術檢測無精癥、少精癥患者中最易缺失的AZFc區(qū)DAZ基因在不同組織中的表達情況，并采用PCR-SSCP方法對DAZ基因內(nèi)橫跨1個外顯子和1個內(nèi)含子的sY254位點的點突變進行分析。首次證實部分漢族無精癥患者可能與AZFc的缺失有關。對精神分裂癥的分子診斷標記研究中，針對國內(nèi)外十分關注的精神分裂癥可能的易感基因5-HTR2A，探討了其102T/C SNP在2個漢族群體精神分裂癥群體中的分布，初步否定了關聯(lián)性。針對1個少見的常染色體顯性遺傳Stargardt黃斑營養(yǎng)不良-3樣家系，篩查了目前已知與STGD相關的3個候選基因ELOVL4、RDS和ABCR的突變信息，提示STGD3可能存在別的未知基因突變。論文發(fā)表于《Journal of Cellular and Molecular Medicine》，并被國際著名的"GeneCards"數(shù)據(jù)庫（http://www.genecards.org/）列位該病研究的Top 10文獻。（分子遺傳學；論文[9]、[10]）

主要完成人：  1.   郭俊明

在本項目的第1、2發(fā)現(xiàn)點上做出了創(chuàng)造性貢獻，建立了血液中微量消化系腫瘤細胞的檢測方法。論文1-5、12的通訊作者，論文7、11、14的共同作者。本人在該項研究中的工作量占本人工作量的60%。

2.   張咸寧

在本項目的第3、4發(fā)現(xiàn)點上做出了創(chuàng)造性貢獻，建立了分子遺傳學新檢測技術及其應用。論文6-8、10、13-17的通訊作者，論文9的共同作者。本人在該項研究中的工作量占本人工作量的60%。

3.   肖丙秀

在本項目的第1、2發(fā)現(xiàn)點上做出了創(chuàng)造性貢獻，參與建立檢測腫瘤微轉移的新技術。論文1-5、11、12的共同作者。本人在該項研究中的工作量占本人工作量的55%。

4.   張新軍

在本項目的第2發(fā)現(xiàn)點上做出了創(chuàng)造性貢獻，參與惡性腫瘤微轉移檢測新技術的研究和臨床應用。論文1、4的共同作者，論文11的通訊作者。本人在該項研究中的工作量占本人工作量的35%。

5.   樂燕萍

在本項目的第3、4發(fā)現(xiàn)點上做出了創(chuàng)造性貢獻，參與分子遺傳新技術的研究和應用。論文6、8的共同作者。本人在該項研究中的工作量占本人工作量的35%。

10篇代表性論文：  1.   Combined use of positive and negative immunomagnetic isolation followed by real-time RT-PCR for detection of the circulating tumor cells in patients with colorectal cancers/ Journal of Molecular Medic

2.   3種富集胃癌患者外周血中胃癌細胞方法的比較/世界華人消化雜志

3.   免疫磁珠與熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應在胃癌患者外周血癌細胞檢測中的應用價值/中華檢驗醫(yī)學雜志

4.   Detection of cytokeratin 20 mRNA in the peripheral blood of patients with colorectal cancer by immunomagnetic beads enrichment and real time reverse transcriptase-polymeras chain reaction/ Journal of

5.   Detecting AFP mRNA in peripheral blood of the patients with hepatocellular carcinoma, liver cirrhosis and hepatitis/Clinica Chimica Acta

6.   A novel mutation of keratin 9 gene (R162P) in a Japanese family with epidermolytic palmoplantar keratoderma/ British Journal of Dermatology

7.   An insertion-deletion mutation in keratin 9 in three Chinese families with epidermolytic palmoplantar keratoderma/ British Journal of Dermatology

8.   注意缺陷多動障礙與兒茶酚-O-甲基轉移酶基因Vall58Met多態(tài)性的關聯(lián)分析/中華醫(yī)學遺傳學雜志

9.   無精癥、少精癥患者中AZF缺失的檢測/生殖與避孕

10.  102T/C SNP in the 5-hydroxytryptamine receptor 2A (HTR2A) gene and schizophrenia in two southern Han Chinese populations: Lack of association/ American Journal of Medical Genetics Part B-Neuropsychiat