項(xiàng)目名稱：    對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）基因組和蛋白質(zhì)組研究

推薦單位：    國家海洋局

項(xiàng)目簡介：    對蝦白斑綜合癥病毒W(wǎng)SSV最早出現(xiàn)在上世紀(jì)90年代初，是一種具有高度感染性和致死性的病毒，嚴(yán)重危害全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，僅我國自1993年爆發(fā)以來已累計(jì)損失數(shù)百億元，成為海水養(yǎng)殖業(yè)危害最大的病毒。WSSV的肆虐立刻引起了許多國家和地區(qū)（中國、美國、日本、臺灣地區(qū)、荷蘭、印度、韓國、新加坡等）的高度重視，但由于缺乏對病毒遺傳信息和功能特性的了解，影響了病毒的防治研究。

本項(xiàng)目組針對國內(nèi)外在WSSV研究方面的難點(diǎn)，自1995年起開展了該病毒基因組分離和純化，克服了在提取過程中病毒基因組被降解和宿主DNA污染的問題，獲得了高純度完整的病毒基因組DNA，經(jīng)電泳分析首次發(fā)現(xiàn)該病毒的基因組超過290kb，是一種尚未被人們所揭示的大病毒。在突破了該技術(shù)難點(diǎn)后，項(xiàng)目組開展了病毒結(jié)構(gòu)基因組研究，率先在國際上破譯了WSSV全基因組序列，其大小為305kb，是目前發(fā)現(xiàn)的最大病毒之一，預(yù)測編碼基因約180個，與以往發(fā)現(xiàn)的病毒無任何同源性。該成果被科技部評為1999年中國基礎(chǔ)科學(xué)研究十大新聞，并于2000年被兩院院士評為中國十大科技進(jìn)展新聞。上述發(fā)現(xiàn)不僅對WSSV的分子遺傳背景有了全面的了解，而且促使國際病毒分類委員會（ICTV）對WSSV分類地位的重新確認(rèn)，將其單獨(dú)歸在新命名的病毒科Nimaviridae和病毒屬Whispovirus。

隨后項(xiàng)目組開展了WSSV功能基因和蛋白質(zhì)組的研究，首次利用蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)鑒定了約20多個病毒結(jié)構(gòu)蛋白，并利用蛋白印跡和金標(biāo)免疫電鏡術(shù)確證了其中8個病毒膜蛋白。隨后通過電泳分離結(jié)合質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)實(shí)際上病毒粒子由20多種膜蛋白和8種核衣殼蛋白組成，使我們對該病毒粒子的基本結(jié)構(gòu)有了較為深刻的認(rèn)識，有助于進(jìn)一步揭示病毒粒子的感染和包裝過程，以及與宿主的相互作用，為建立特異性阻斷病毒感染的方式提供了科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。

本項(xiàng)目共發(fā)表國際SCI論文17 篇，其中影響因子超過3的10 篇。他引（正面引用）總次數(shù)191篇，其中單篇他引次數(shù)超過8的有8篇。

主要發(fā)現(xiàn)點(diǎn)：  1. 首次建立對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）基因組純化技術(shù)，該方法擯棄了常規(guī)純化病毒所采用的密度梯度超速離心，不僅大大縮減了純化步驟和時間，提高了病毒得率，而且在提取過程利用蛋白質(zhì)抑制劑預(yù)防蝦組織蛋白酶對病毒粒子的損害，再加上DNase處理除去宿主基因組污染，使最后獲得的病毒基因組DNA純度非常高，保證了高質(zhì)量病毒基因組文庫的構(gòu)建。另外我們還發(fā)展了一種從感染W(wǎng)SSV的螯蝦組織中快速制備病毒的方法，能獲得大量高純度有感染活性的病毒粒子，有利于病毒膜蛋白的功能研究和病毒感染機(jī)理研究。所屬學(xué)科分類：水產(chǎn)保護(hù)學(xué)；代表性論文-1和8

2. 在國際上率先完成WSSV全基因組序列測定，基因組大小為305kb，是目前最大的病毒之一（目前發(fā)現(xiàn)基因組超過300kb的病毒總計(jì)7個，見http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/static/vis.html），約有180個編碼基因，有9個可能的復(fù)制起始區(qū)。同源性檢索顯示，除了幾個與核酸代謝相關(guān)的基因有一定的同源性外，95%以上的基因或其編碼蛋白與已知的病毒基因或蛋白沒有任何同源性，另外還發(fā)現(xiàn)一個以往從未在病毒基因組中存在的膠原蛋白基因，說明WSSV是一個全新的病毒。 所屬學(xué)科分類：水產(chǎn)保護(hù)學(xué)；代表性論文-2和6

3. 在國際上最先開展WSSV的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，首次鑒定了20多個病毒結(jié)構(gòu)蛋白，并利用免疫電鏡進(jìn)行了病毒膜蛋白的定位驗(yàn)證研究，并且糾正了病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP26最初被認(rèn)為是核衣殼蛋白的錯誤觀點(diǎn)，同時發(fā)現(xiàn)該蛋白能與宿主細(xì)胞的骨架蛋白Actin有相互作用，暗示VP26在病毒粒子入核過程中起重要作用。另外抗體中和試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多種病毒膜蛋白的抗體具有中和病毒感染的作用，表明這些膜蛋白可能與WSSV的感染直接相關(guān)，對進(jìn)一步開展抗病毒研究有重要意義。 所屬學(xué)科分類：水產(chǎn)保護(hù)學(xué)；代表性論文-3, 4, 5和7

4. 國際上第一個報道了確證功能的WSSV基因，wsv214，它的編碼產(chǎn)物為強(qiáng)堿性多肽，具有DNA結(jié)合的功能，估計(jì)類似于真核生物組蛋白，起壓縮和包裝基因組DNA的作用。 所屬學(xué)科分類：水產(chǎn)保護(hù)學(xué)；代表性論文-9

5. 首次發(fā)現(xiàn)WSSV基因組上有一易變區(qū)，不同來源的病毒株在該區(qū)域發(fā)生了大片段DNA缺失現(xiàn)象，最大達(dá)8kb以上，包含了5個編碼基因，經(jīng)感染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，片段缺失僅導(dǎo)致病毒的毒力減弱，并不影響其感染活性，提示病毒的缺失基因可能與病毒的毒力相關(guān)。所屬學(xué)科分類：水產(chǎn)保護(hù)學(xué)；代表性論文-10

主要完成人：  1.   楊豐

建立了WSSV的基因組DNA純化技術(shù)，病毒基因組DNA文庫和cDNA文庫構(gòu)建，病毒全基因組DNA序列生物信息學(xué)分析，病毒基因的鑒定和功能研究。

2.   章曉波

進(jìn)行WSSV的蛋白質(zhì)組學(xué)及病毒膜蛋白的研究，并指導(dǎo)研究生進(jìn)行WSSV基因功能、RNAi等研究，撰寫研究論文。

3.   徐洵

1995-2002 負(fù)責(zé)本課題的啟動，設(shè)計(jì)，研究生指導(dǎo)和論文撰寫。2001年以后開始啟動對蝦抗病毒分子基礎(chǔ)的研究。

10篇代表性論文：  1.   A simple and efficient method for purification of prawn baculovirus DNA. J. Virol. Methods, 67, 1-4

2.   Complete genome sequence of the shrimp White Spot Bacilliform Virus. J. Virol., 75 (23), 11811-20

3.   Proteomic analysis of shrimp white spot syndrome viral proteins and characterization of a novel envelope protein VP466. Mol Cell Proteomics. 1(3):223-31

4.   Transcription and identification of an envelope protein gene (p22) from shrimp white spot syndrome virus. J Gen Virol., 83: 471-7

5.   Identification of white spot syndrome virus (WSSV) envelope proteins involved in shrimp infection. Virology. 332(2):578-83.

6.   Identification of a collagen-like protein gene from white spot syndrome virus. Arch Virol., 149:215-23

7.   Interaction of white spot syndrome virus VP26 protein with actin. Virology. 336(1):93-9

8.   A simple and efficient method for purification of intact White Spot Syndrome Virus (WSSV) viral particles. Virus Res. 108, 63-7

9.   The structure and function of a gene encoding a basic peptide from prawn white spot syndrome virus. Virus Res. 79:137-44

10.  Genomic instability of prawn white spot bacilliform virus (WSBV) and its association to virus virulence. Virus Res. 2002, 90: 269-74