項(xiàng)目名稱：    魚類生長(zhǎng)的內(nèi)分泌學(xué)及其調(diào)控機(jī)制研究

推薦單位：    農(nóng)業(yè)部

項(xiàng)目簡(jiǎn)介：    本項(xiàng)目屬水產(chǎn)生物學(xué)領(lǐng)域。20年來(lái)，本項(xiàng)目對(duì)魚類生長(zhǎng)激素（GH）分離純化、免疫測(cè)定技術(shù)、基因克隆、分泌調(diào)節(jié)機(jī)理及重組表達(dá)等進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究，不僅建立了我國(guó)魚類GH和生長(zhǎng)內(nèi)分泌學(xué)的研究體系，而且形成了我國(guó)魚類生長(zhǎng)內(nèi)分泌學(xué)科，取得的主要發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)新性成果包括：（1）分離純化草魚等多種魚類GH并制備其抗體；創(chuàng)建了鯉科、鮨科和鯛科等6種魚類GH酶標(biāo)/放射免疫測(cè)定技術(shù)；（2）發(fā)現(xiàn)魚類垂體GH的分泌屬陣發(fā)式分泌型，分泌活動(dòng)有明顯季節(jié)性和日周期變化規(guī)律；闡明GH分泌活動(dòng)與魚體生長(zhǎng)速率之間的關(guān)系；（3）發(fā)現(xiàn)魚類GH分泌活動(dòng)受多種神經(jīng)內(nèi)分泌因子的調(diào)控，其中促性腺激素釋放激素（GnRH）、促甲狀腺素釋放激素（TRH）、多巴胺及其激動(dòng)劑等都能刺激GH分泌，而生長(zhǎng)抑素（SRIF）則抑制GH分泌；（4）發(fā)現(xiàn)IGF對(duì)GH基因表達(dá)的負(fù)反饋調(diào)控是通過(guò)激活垂體中鈣調(diào)素基因的表達(dá)而進(jìn)行的；（5）發(fā)現(xiàn)PACAP通過(guò)PAC-I型受體刺激垂體GH釋放和基因表達(dá)的機(jī)制；（6）發(fā)現(xiàn)去甲腎上腺素通過(guò)激活a2腎上腺素受體抑制GH分泌的信號(hào)通路；（7）發(fā)現(xiàn)魚類GH自分泌和旁分泌的反饋調(diào)節(jié)通路，建立了魚類GH自分泌和旁分泌反饋調(diào)節(jié)的模型；（8）發(fā)現(xiàn)刺激GH分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌因子等通過(guò)口服途徑能顯著促進(jìn)GH分泌和提高魚體生長(zhǎng)速率，且這些因子共同使用，其促生長(zhǎng)效果更為顯著；（9）構(gòu)建了斜帶石斑魚等多種魚類cDNA文庫(kù)，克隆了GH、IGF和PACAP等生長(zhǎng)相關(guān)功能基因10多個(gè)，研制了基因重組GH；采用投喂方法證明它能為魚消化道吸收而促進(jìn)魚體生長(zhǎng)；（10）本項(xiàng)目發(fā)表論文148篇，其中SCI論文51篇，SCI引用597次，其中SCI他引443次；（11）本項(xiàng)目申請(qǐng)發(fā)明專利7項(xiàng)，其中1項(xiàng)獲得授權(quán)；（12）這些成果不僅使我國(guó)魚類生長(zhǎng)內(nèi)分泌學(xué)研究達(dá)國(guó)際領(lǐng)先水平，極大促進(jìn)了我國(guó)魚類內(nèi)分泌學(xué)科的發(fā)展，而且對(duì)于世界魚類內(nèi)分泌學(xué)科的發(fā)展也作出了重要貢獻(xiàn)，同時(shí)，這些成果對(duì)于促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的科技進(jìn)步具有重要科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。

主要發(fā)現(xiàn)點(diǎn)：  （1）發(fā)現(xiàn)垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽(PACAP)神經(jīng)纖維進(jìn)入魚類生長(zhǎng)激素(GH)細(xì)胞內(nèi)的解剖學(xué)證據(jù)，闡明PACAP通過(guò)PAC-I型受體刺激垂體GH釋放和基因表達(dá)的機(jī)制，首次提出了介導(dǎo)PACAP刺激GH分泌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的模型，克隆了魚類第一個(gè)PACAP受體基因（代表性論文1、7和14; 所屬學(xué)科：水生生物生理學(xué)）；（2）發(fā)現(xiàn)促性腺激素釋放激素（GnRH）、促甲狀腺素釋放激素（TRH）、多巴胺激動(dòng)劑（APO、SKF等）、PACAP、性類固醇激素（如雌二醇）等都能顯著刺激各種魚類腦垂體釋放GH（代表性論文2、4和5）；（3）發(fā)現(xiàn)多巴胺（Dopamine）通過(guò)激活D1型-受體刺激魚類垂體細(xì)胞釋放GH，而這種刺激作用受生長(zhǎng)抑素和性類固醇激素的負(fù)調(diào)節(jié)；發(fā)現(xiàn)多巴胺是魚類性腺退化期GH釋放的主要刺激因子，而GnRH則是性腺成熟期主要的GH釋放因子；首次揭示了多巴胺刺激魚類GH分泌的信號(hào)通路（代表論文3，9）；闡明了魚類GH分泌的多因子調(diào)控機(jī)制（代表論文9; 所屬學(xué)科：水生生物生理學(xué)）；（4）首次發(fā)現(xiàn)魚類GH分泌為陣發(fā)式分泌，揭示草魚血清GH水平存在明顯的季節(jié)性和日周期性變化規(guī)律（代表性論文6; 所屬學(xué)科：水產(chǎn)生物學(xué)）；（5）發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）對(duì)GH基因表達(dá)的負(fù)反饋調(diào)控是通過(guò)激活鈣調(diào)素基因的表達(dá)而進(jìn)行的（論文16）；（6）發(fā)現(xiàn)去甲腎上腺素通過(guò)激活a2腎上腺素受體抑制GH分泌的信號(hào)通路，這種抑制作用是通過(guò)抑制cAMP的生產(chǎn)以及其它的下游信號(hào)通路進(jìn)行的，主要包括通過(guò)激活cAMP-, Ca2+-和 PKC-依賴的信號(hào)通路阻止GH分泌刺激信號(hào)的輸入（論文35; 學(xué)科：水生生物生理學(xué)）；（7）發(fā)現(xiàn)魚類GH和LH通過(guò)自分泌和旁分泌相互作用調(diào)節(jié)GH釋放和GH基因表達(dá)的一個(gè)新的垂體內(nèi)反饋通路，建立了魚類GH自分泌和旁分泌反饋調(diào)節(jié)的模型；發(fā)現(xiàn)GH在垂體水平通過(guò)與JAK2/MAPK and JAK2/PI3K 信號(hào)通路偶聯(lián)的GH受體發(fā)揮作用，上調(diào)GH分泌和GH基因表達(dá)；GH對(duì)其分泌和合成的正向自我調(diào)節(jié)作用代表魚類生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的新機(jī)制（論文11、24和25; 所屬學(xué)科：水生生物生理學(xué)）；（8）發(fā)現(xiàn)刺激GH分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌因子如GnRH類似物、多巴胺激動(dòng)劑、生長(zhǎng)抑素抑制劑等通過(guò)口服途徑能顯著促進(jìn)魚類GH分泌和提高魚體生長(zhǎng)速率，且這些因子共同使用，其促生長(zhǎng)效果最為顯著（代表性論文8和43；所屬學(xué)科：水產(chǎn)生物學(xué)）；（9）發(fā)現(xiàn)半胱胺（CSH）在魚類起著生長(zhǎng)抑素抑制劑的作用，能顯著刺激草魚、石斑魚腦垂體釋放GH和提高生長(zhǎng)速率（論文26和29；所屬學(xué)科：水產(chǎn)生物學(xué)）；（10）構(gòu)建了斜帶石斑魚等多種魚類cDNA文庫(kù)，克隆了GH、IGF和PACAP等生長(zhǎng)相關(guān)功能基因20多個(gè)，研制了基因重組GH；采用投喂方法證明它能為魚消化道吸收而促進(jìn)魚體生長(zhǎng)（代表性論文10、27、32）；（11）創(chuàng)建了鯉科魚類GH單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系和酶聯(lián)免疫測(cè)定技術(shù)、鮨科和鯛科魚類生長(zhǎng)激素放射免疫測(cè)定技術(shù)、鯉科和鯛科魚類生長(zhǎng)激素酶標(biāo)受體或放射受體分析法以及魚類腦垂體碎片離體孵育灌流系統(tǒng)等一系列技術(shù)方法（論文40、41）（所屬學(xué)科：水產(chǎn)生物學(xué)）。

主要完成人：  1.   林浩然

為項(xiàng)目負(fù)責(zé)人，對(duì)發(fā)現(xiàn)點(diǎn)2、3、5、8、9、10和11作出創(chuàng)造性貢獻(xiàn)，在該項(xiàng)目中的工作量占本人工作量的70%以上。 建立了魚類GH放射免疫測(cè)定技術(shù)和垂體離體孵育灌流系統(tǒng); 首次證明魚類生長(zhǎng)激素分泌特點(diǎn)和哺乳類相似，亦是陣發(fā)式分泌型; 發(fā)現(xiàn)促性腺激素釋放激素LHRH-A和sGnRH-A不僅刺激魚類GTH分泌的活性最強(qiáng)，而且刺激GH分泌的活性亦最強(qiáng)；證明TRH，多巴胺激動(dòng)劑（如APO，SKF等），性類固醇激素和生長(zhǎng)抑素抑制劑（CSH）等都能顯著刺激鯉魚腦垂體分泌GH和魚體生長(zhǎng); 采用投喂方法證明魚類消化道能吸收外源多肽激素和藥物并保持其生物活性; 采用基因工程技術(shù)研究GH，IGF，PACAP等基因的結(jié)構(gòu)和功能，獲得基因重組產(chǎn)物，為基因重組產(chǎn)品開(kāi)發(fā)利用打下基礎(chǔ)。

2.   陳松林

為該項(xiàng)目中部分課題的負(fù)責(zé)人。對(duì)發(fā)現(xiàn)點(diǎn)4、8、9、10和11作出創(chuàng)造性貢獻(xiàn)，在該項(xiàng)目中的工作量占本人工作量的60%以上。為國(guó)內(nèi)最早開(kāi)展魚類生長(zhǎng)激素（GH）和生長(zhǎng)內(nèi)分泌研究的學(xué)者之一，建立了從同一批魚垂體中分離純化GH、催乳激素和促甲狀腺素的技術(shù)方法；分離純化出草魚GH，建立了分泌抗草魚GH單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，建立了既能測(cè)定GH生物活性、又能測(cè)定其免疫活性的酶標(biāo)受體測(cè)定方法；建立了鯉科魚類GH夾心式酶標(biāo)免疫測(cè)定技術(shù)（ELISA）；發(fā)現(xiàn)草魚種體內(nèi)GH分泌存在季節(jié)性和日變化規(guī)律；闡明了外源GH在魚體內(nèi)的代謝規(guī)律； 最早提出將半胱胺（CSH）作為魚類生長(zhǎng)抑素抑制劑的研究思路；克隆了鰱生長(zhǎng)激素基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)。

3.   李文笙

對(duì)發(fā)現(xiàn)點(diǎn)1、2、8、10和11作出創(chuàng)造性貢獻(xiàn)，在項(xiàng)目中的工作量占本人工作量的60%以上。負(fù)責(zé)建立液相雜交/RNase 保護(hù)法檢測(cè)鯉魚GH基礎(chǔ)mRNA水平的年周期變化；負(fù)責(zé)完成促性腺激素釋放激素及其類似物、生長(zhǎng)激素釋放因子和抑制因子對(duì)鯉魚腦垂體GH分泌和GH mRNA 水平影響的研究；負(fù)責(zé)完成甲狀腺激素和促甲狀腺素釋放激素對(duì)鯉魚GH分泌和GH mRNA水平影響的研究；負(fù)責(zé)完成性類固醇激素對(duì)鯉魚GH分泌和基因表達(dá)調(diào)控作用的研究；負(fù)責(zé)完成石斑魚GH基因的克隆和表達(dá)研究；參加并指導(dǎo)完成石斑魚GH放射免疫測(cè)定方法和ELISA方法的建立；完成石斑魚胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）Ⅰ和Ⅱ基因，腦垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽（PACAP）基因等的克隆、時(shí)空表達(dá)分析等工作。

4.   黃安林

對(duì)發(fā)現(xiàn)點(diǎn)1、3、5、6、7作出創(chuàng)造性貢獻(xiàn)，在該項(xiàng)目中的工作量超過(guò)本人工作量的60%。首次闡明GnRH和DA D1－刺激的GH釋放的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制; 發(fā)現(xiàn)PACAP神經(jīng)纖維進(jìn)入GH細(xì)胞內(nèi)的解剖學(xué)證據(jù)，闡明PACAP通過(guò)PAC-I型受體刺激垂體GH釋放和基因表達(dá)的機(jī)制，提出了介導(dǎo)PACAP刺激GH分泌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的模型; 用草魚作為模型，發(fā)現(xiàn)在GH和LH之間通過(guò)自分泌和旁分泌相互作用調(diào)節(jié)GH釋放和GH基因表達(dá)的一個(gè)新的垂體內(nèi)反饋通路; 首次發(fā)現(xiàn)GH在垂體水平通過(guò)與JAK2/MAPK and JAK2/PI3K 信號(hào)通路偶聯(lián)的GH受體上發(fā)揮作用，上調(diào)GH分泌和GH基因表達(dá); 首次發(fā)現(xiàn)促性腺激素細(xì)胞分泌的LH能夠以旁分泌的形式促進(jìn)GH分泌細(xì)胞中GH轉(zhuǎn)錄子的翻譯和GH基因的轉(zhuǎn)錄。

5.   張為民

對(duì)發(fā)現(xiàn)點(diǎn)4、10和11作出創(chuàng)造性貢獻(xiàn)，在該項(xiàng)目中的工作量占本人工作量的40%以上。 參加實(shí)驗(yàn)并證明魚類生長(zhǎng)激素分泌活動(dòng)的特點(diǎn)是陣發(fā)式分泌; 系統(tǒng)觀察與測(cè)定草魚血清生長(zhǎng)激素，含量的晝夜變化; 參加實(shí)驗(yàn)并證明草魚在饑餓一段時(shí)間后再投喂，出現(xiàn)明顯的補(bǔ)償生長(zhǎng); 參加草魚基因重組生長(zhǎng)激素的分離純化實(shí)驗(yàn)，為生產(chǎn)草魚基因生長(zhǎng)激素提出有效的技術(shù)路線; 參加斜帶石斑魚生長(zhǎng)激素cDNA克隆并在大腸桿菌進(jìn)行融合表達(dá); 參加黑鯛生長(zhǎng)激素受體基因克隆及表達(dá)調(diào)節(jié)。

10篇代表性論文：  1.   Hypophysiotropic action of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the goldfish: Immunohistochemical demonstration of PACAP in the pituitary, PACAP stimulation of growth hormone

2.   Growth hormone and gonadotropin secretion in the common carp (Cyprinus carpio): In vitro interactions of gonadotropin-releasing hormone, somatostatin, and the dopamine agonist apomorphine. General and

3.   Dopamine stimulates growth hormone release from the pituitary of goldfish, Carassius auratus, through the dopamine D1 receptors. Endocrinology 130: 1201-1210

4.   The regulatory effects of thyrotropin-releasing hormone (TRH) on growth hormone secretion from perfused pituitary of common carp in vitro. Fish Physiology and Biochemistry, 11: 71-76.

5.   Effects of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) analogs and sex steriods on growth hormone (GH) secretion in common carp (Cyprinus carpio) and grass carp (Ctenopharyngodon idellus). Aquaculture, 135:

6.   Espodic growth hormone secretion in the grass carp, Ctenopharyngodon idellus. General and Comparative Endocrinology, 95: 337-341.

7.   Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide as a novel hypophysiotropic factor in fish. Biochem. Cell. Biol. 78:329-343

8.   Effects of gonadotropin-releasing hormone on growth hormone secretion and gene expression in common carp pituitary. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B. 132: 335~341.

9.   Interactions of somatostatin, gonadotropin- releasing hormone, and the gonads on dopamine-stimulated growth hormone release in the goldfish. Gen Comp Endocrinol 92:366-378

10.  Development and validation of a Noncompetitive enzyme-linked immunosorbent assay for the growth hormone of grass carp (Ctenopharyngodon idellus). Acta Zoologica Sinica 42,(2):386-393.